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在多肽合成中，羧基和羟基是两类常见的官能团。羧基是构建肽键的基本结构单元，羟基则因亲核性在侧链保护和脱保护中频繁参与反应，两者在多肽合成中扮演着关键角色。然而，因其反应活性较高，两者易在合成过程中发生多种非预期的副反应，直接影响目标产物的纯度与收率。下面我们梳理了这两个基团的常见副反应，以期在实际操作中提供参考。
羧基副反应主要集中在天冬氨酸（Asp）/谷氨酸（Glu）的骨架和侧链上，主要包括以下几类：
1. 碱催化下的酯交换反应
在固相合成中，采用氯甲基树脂（Merrifield树脂）时，氨基酸经碱催化的取代反应以酯键的形式固定在树脂上，常用的碱包括铯盐、三乙胺、四甲基氢氧化铵（TMAH）等，其中TMAH催化效果更优。但问题在于，该过程会伴随有Asp/Glu侧链上的苄基酯发生酯交换副反应，如下图1，在甲醇体系中，苄基酯转换成甲酯，而在后续的HF介导的侧链脱保护步骤中，难以实现侧链去屏蔽。
图1 Asp/Glu侧链的酯交换副反应
不过，这一副反应若加以利用，也是一种有效的合成策略。例如，采用TMAH/叔丁醇在70°C处理肽基-Merrifield树脂，可将Asp/Glu侧链的苄酯转化为叔丁酯，同时实现肽链从固相载体上的切割，直接得到相应的C端叔丁酯。
2. 裂解与纯化过程中的甲酯化副反应
在肽树脂裂解或侧链全局脱保护过程中，若残留甲醇（如洗涤带入），在酸性环境下会修饰多肽中的羧基，引发甲酯化副反应。因此，对于酯化敏感的肽，应避免使用甲醇洗涤树脂，或严格控制干燥过程。
此外， 在反相液相色谱中进行提纯时，甲醇因成本优势被广泛用作有机洗脱剂，而甲醇/水体系中通常需加入TFA或甲酸等酸性改性剂，收集到的肽溶液呈酸性。在后续的浓缩过程中，Asp/Glu侧链羧基或肽骨架羧基极易发生甲酯化反应，影响多肽质量。若甲酯化倾向较为严重，建议改用乙腈作为有机洗脱剂。
丝氨酸（Ser）/苏氨酸（Thr）因其β-羟基具有亲核性，在多肽合成中易发生多种副反应。同时，羟基上的酰基保护基也会在特定条件下经历诸如O→N迁移，β-消除等副反应。
1. 烷基化副反应
Alloc保护基因此独特的正交性，常用于羟基的选择性保护。但O-Alloc保护的丝氨酸残基在Pd(0)催化下脱除时，Alloc保护的羟基可能发生O-烯丙基化副反应，生成O-烯丙基保护的丝氨酸副产物（图2）。这个副产物对Pd(0)化学稳定，无法通过延长处理时间再生游离的β-羟基。不过，在有效丙烯酸清除剂存在下，该副反应可得到有效控制。
图2 Alloc脱保护引发的烯丙基化副反应
2. 酰化及O→N迁移副反应
在氨基酸偶联过程中，若使用过量酰化试剂或目标氨基酸反应缓慢，则可能缩小羟基与氨基之间的亲核性差异，导致Ser/Thr的β-羟基发生酰化副反应。此外，在氨基保护基团脱保护以及后续的碱处理过程中，已酰化的羟基会发生酰基O→N迁移，导致肽链意外终止（图3）。
图3 酰基O→N迁移反应
3. β-消除副反应
β-消除反应是Ser/Thr中常见的副反应之一。当Ser/Thr侧链羟基上连有吸电子基团（如Ts、Ms等）时，在碱性条件下极易发生β-消除反应（图4）。
图4 碱催化下的β-消除反应
即使侧链未保护的Ser/Thr，也并非完全避免此类反应发生。在碱浓度、温度、反应时间和肽序列等因素影响下，β-消除反应仍有可能发生。此外，部分偶联试剂也能诱导这一副反应的发生，例如，DSC、CDI以及碳二亚胺类偶联试剂可活化Ser/Thr的β-羟基，继而引发β-消除反应（图5）。
图5 CDI引发的β-消除反应
4. 噁唑类副产物的形成
噁唑类副产物的形成主要有两种情况：其一是当N端采用氨基甲酸酯（Z、Boc等）保护时，侧链未保护的Ser/Thr在碱性条件下，β-羟基可能会进攻骨架氨基甲酸酯部分，形成噁唑烷酮副产物（图6）。因此，对肽进行碱处理时，将N端Ser/Thr的β-羟基进行保护，或采用更温和的条件能有效避免副反应的发生。
图6 噁唑烷酮形成机制
其二是肽链内部的Ser/Thr残基也能通过β-羟基进攻邻近肽键，生成五元环中间体。这个中间体一方面可经酰基N→O迁移转化为酯衍生物；另一方面可经脱水和氧化转化为噁唑啉甚至噁唑产物（图7）。类似的过程也见于半胱氨酸（Cys）和β-氨基丙氨酸，分别生成相应的噻唑啉/噻唑和咪唑啉/咪唑衍生物。
图7 异构体肽酯/噁唑（啉）形成机制
5. 逆羟醛缩合裂解
Ser/Thr侧链游离的β-羟基与邻近的羰基构成了β-羟基羰基结构——本质上为羟醛缩合后产物结构，因此，在酸碱条件下都可能发生逆羟醛缩合裂解。在碱性条件下，这一过程会导致Ser/Thr残基的Cα—Cβ键断裂，生成甲醛/乙醛和相应的酮类化合物（图8）。尽管此类副反应不常见，但在多肽合成或其他相关处理过程中仍需留意。
图8 逆羟醛缩合裂解
以上梳理的为较为常见和典型的副反应类型。在实际合成中，羧基和羟基相关的副反应形式多样、机制复杂，但多数可以通过合理的保护基选择、严格的工艺参数控制以及适当的反应条件优化来避免。充分了解这些副反应的规律，是提升多肽药物质量与收率的重要基础。
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参考文献：
[1] Side Reactions in Peptide Synthesis. Yi Yang.
